如何用人工氣候培養(yǎng)箱制備重癥中暑小鼠模型

重癥中暑（severe heat stroke）是一種危及生命的熱致性疾病，可繼發(fā)全身炎癥反應，導致多器官功能障礙綜合征，具有高病死率和高致殘率的特點。腸屏障是抵抗病原微生物的第一道屏障，重癥中暑繼發(fā)的腸黏膜損傷破壞了腸屏障功能，是驅動內(nèi)毒素血癥、全身炎癥反應及多器官功能障礙綜合征發(fā)生發(fā)展的關鍵因素。然而，重癥中暑導致腸黏膜損傷的分子機制仍未明確。當各種應激因素破壞內(nèi)質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)誘導未折疊或錯誤折疊蛋白累積時，可誘導內(nèi)質網(wǎng)應激。內(nèi)質網(wǎng)應激的初衷是恢復細胞穩(wěn)態(tài)，若損傷過重導致內(nèi)質網(wǎng)應激過于強烈或持久則可激活細胞死亡途徑。腸黏膜上皮具有豐富的內(nèi)質網(wǎng)結構，處理內(nèi)質網(wǎng)應激的能力是決定腸道保持穩(wěn)態(tài)抑或是發(fā)生病變的重要因素。內(nèi)質網(wǎng)應激參與了炎癥性腸病、腸道腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展過程。NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）是NOD樣受體家族的重要成員，與接頭蛋白和效應分子結合形成炎癥小體參與宿主的免疫應答和多種疾病的病理生理過程。新近研究表明內(nèi)質網(wǎng)應激能激活NLRP3炎癥小體介導炎癥反應，而炎癥反應是重癥中暑繼發(fā)組織損傷的重要病理改變。內(nèi)質網(wǎng)應激和NLRP3炎癥小體活化是否參與了重癥中暑導致的腸黏膜損傷目前鮮見報道。4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）作為一種內(nèi)質網(wǎng)應激抑制劑，可穩(wěn)定肽鏈結構，加強內(nèi)質網(wǎng)折疊能力并清除錯誤折疊蛋白。4-PBA現(xiàn)已用于臨床治療尿素循環(huán)障礙和鐮狀細胞病，并在多種疾病尤其是炎癥性疾病的治療中顯示出潛在的應用前景。在膿毒癥休克大鼠模型中，4-PBA通過抑制內(nèi)質網(wǎng)應激介導的炎癥反應、細胞凋亡和氧化應激，保護重要臟器的功能。還有研究表明，4-PBA可通過調節(jié)破骨細胞中的自噬防止脂多糖引起的炎癥性骨質流失。

      本研究通過制備HS小鼠模型，觀察內(nèi)質網(wǎng)應激和NLRP3炎癥小體的活化情況，使用4-PBA預處理抑制內(nèi)質網(wǎng)應激，從而反向驗證內(nèi)質網(wǎng)應激在HS腸黏膜損傷中的作用，并觀察4-PBA對HS腸黏膜損傷是否具有保護作用。

      實驗前小鼠于明暗交替（12h光照/黑暗循環(huán)）的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)一周，環(huán)境溫度為（25.0±0.5）℃，環(huán)境濕度為（35.0±5.0）%，并允許其隨意飲水和進食。小鼠隨機（隨機數(shù)字表法）分為對照（control）組、HS組和4-PBA預處理組（4-PBA+HS）。實驗開始后，將HS組和4-PBA+HS組小鼠置于預熱的高溫人工氣候培養(yǎng)箱中，溫度保持于（35.5±0.5）℃，濕度保持于（60.0±5.0）%。4-PBA預處理組的小鼠在接受熱暴露之前予以腹腔注射4-PBA 120 mg/kg 。而對照組的小鼠保持在環(huán)境溫度為（25.0±0.5）℃，濕度為（35.0±5.0）%。用直腸溫度計連續(xù)監(jiān)測直腸核心溫度（Tc）。前期的研究表明，當小鼠Tc達到42℃時，即成功建立了HS小鼠模型。在Tc達到42℃后，小鼠接受復溫處理。復溫策略如下：將小鼠從高溫人工氣候培養(yǎng)箱中取出并在環(huán)境溫度（25.0±0.5）℃和濕度（35.0±5.0）%的條件下冷卻，允許小鼠自由飲水。前期的研究表明，HS小鼠的器官損傷程度隨著復溫時間的延長而加重，其平均存活時間約為造模成功后6h。因此，本實驗的后續(xù)檢測選擇了該時間點。在復溫處理6h后，通過頸椎脫位處死所有小鼠，收集血清，采集回腸組織，用4 ℃ PBS沖洗，并儲存于-80 ℃用于進一步研究。